Sinopse:
A noite caiu no Instituto Smithsonian em Washington, EUA. Os guias já foram para casa, as luzes estão apagadas, as crianças estão enfiadas em suas camas... Ainda assim, algo incrível está em atividade enquanto o ex-vigia noturno Larry Daley (Ben Stiller) se descobre atraído por sua mais assombrosa e maior aventura até o momento, na qual a História verdadeiramente ganha vida.

Neste segundo episódio da saga Uma Noite no Museu, Larry enfrenta uma batalha tão épica que só poderia se desenrolar nos corredores do maior museu do mundo. Agora, Larry precisa tentar salvar seus amigos, antes inanimados, do que poderia ser sua última batalha entre as maravilhas do Smithsonian; e todas elas, das famosas pinturas nas paredes às espaçonaves, de repente ganham vontade própria.

No primeiro filme da História a ser filmado no complexo de museus Smithsonian, a diversão começa quando Larry já havia deixado para trás o mundo de baixos salários de vigia de museu para se tornar o inventor requisitado dos produtos de comerciais informativos da Daley Devices. Ele parece ter tudo - mas algo está faltando em sua vida, algo que o atrai de volta à sua velha busca, o Museu de História Natural, onde ele uma vez teve uma noite mágica para lembrar pela vida inteira. Lá, ele faz uma descoberta desconcertante. Seus objetos expostos preferidos, na verdade, alguns de seus amigos mais verdadeiros, foram considerados desatualizados. Encaixotados, eles aguardam a remessa para os amplos arquivos do Smithsonian.